许多用户对溶剂梯度洗脱分离后 LC 色谱柱应该重新平衡多长时间有疑问。在这里，我们展示了对于反相和 HILIC 分离而言，再平衡周期短的令人满意的结果。

        LC 用户通常会提出和讨论关于在溶剂梯度洗脱分离后重新平衡 LC 色谱柱多长时间的问题。在本文中，我们根据最近对该主题的研究讨论了细节，并表明即使对于 HILIC 分离，在两个柱体积数量级的短再平衡周期内也可以获得令人满意的结果。

        一、核心概念

        在溶剂梯度洗脱模式下使用 LC 时，必须有一段时间，通常是在分析结束时，在溶剂梯度的第一部分中使用的流动相流过 LC 色谱柱，为色谱柱做准备。接下来分析。这段时间通常称为再平衡时间。由于冲洗位于泵系统出口和色谱柱入口之间的仪器组件（例如，混合器、连接管和进样器环路），会产生一种指数曲线。认识到这种指数冲洗的发生对于理解溶剂梯度洗脱背景下的色谱柱重新平衡至关重要。这是系统的物理行为问题，组成为 φ i的流动相直到梯度程序结束很久之后才开始再次流过色谱柱。

        二、色谱柱“重新平衡”意味着什么？

        完全重新平衡是指色谱柱的一种状态，即增加重新平衡时间 ( t re-eq  ) 不会进一步影响在后续梯度洗脱分离中分离的分析物的保留时间。换句话说，我们可以将这种状态视为色谱柱与梯度中使用的初始流动相 (φ i ) 真正平衡的状态。

        一些色谱柱的平衡时间也受到键合相影响，氰基键合相对极性化合物具有独特的选择性，比裸硅胶更适合正相梯度分离。氰基官能团是一种强偶极子，可以与其他偶极子相互作用或在溶质上诱导偶极子。由于烷基接头，这些相还表现出适度的疏水性。

        由于CN键合相的快速平衡时间，它是正相模式梯度洗脱的最佳选择。CN 相可用作 Si 相的极性较小的替代品。恒谱生USHA CN氰基柱适合分析双键化合物、循环抗抑郁药等。

         部分、可重复的再平衡：该术语是指色谱柱未与初始流动相完全平衡的状态；然而，只要梯度洗脱分离之间使用的重新平衡时间高度精确，就可以获得高度可重复的分离。

        这两种平衡状态之间的区别很重要，因为 1) 达到完全重新平衡状态可能需要很长时间（在某些情况下是几个小时）；2) 在许多情况下，不需要完全重新平衡液相色谱柱即可获得有用的分析结果。在这些情况下，分离的高度可重复性（例如，通过保留时间的精度来衡量）通常比色谱柱完全重新平衡更为重要，如果分析时间可以通过使用不是不必要的长的重新平衡时间来减少，那么这可以显着提高通量并降低分析成本。

        三、结论

        我们从详细研究反相色谱柱的再平衡中学到了一些东西：如果我们总结在第一次深入研究溶剂梯度洗脱后反相色谱柱重新平衡这一主题期间所做的大量工作，我们最终得出两个主要结论：在达到tflush后，使用梯度中使用的初始流动相，只需一或两根平衡柱就可以获得高度可重复的梯度洗脱分离。

        完全平衡的进展可能会受到多种因素的影响，例如缓冲液浓度和 pH 值，尤其是对于离子分析物。