缓冲液是一种含有弱酸及其共轭碱（或弱碱及其共轭酸）的水溶液。加入少量强酸或强碱后，缓冲溶液的 pH 值变化很小，当小的环境因素发生变化时，有助于抵消分析方法中的条件变化。缓冲溶液用于将 pH 值保持在几乎恒定的值。由于这种弱酸 (HA) 与其共轭碱之间存在平衡，它们对 pH 变化具有抵抗力。

        一、hplc缓冲液的工作原理

        当一些强酸（更多的 H+）被添加到弱酸及其共轭碱的平衡混合物中时，根据 Le Chatelier 原理，平衡向左移动。类似地，如果将强碱添加到混合物中，则氢离子浓度降低的量小于所添加碱量的预期量。

        在准备缓冲液时，您应该遵守一些一般准则：

校准 pH 计；理想情况下，pH 值高于和低于缓冲液制备的目标值；

称出缓冲盐以提供所需的缓冲浓度；

加入装有 HPLC 级水的容量瓶中，充分混合溶解；

使用 pH 探针和 pH 计，测量溶液的 pH；

通过添加少量强酸和/或强碱将 pH 值调节至所需值；

一旦 pH 值正确，将溶液稀释至最终所需体积并充分混合。

        在 HPLC 中，缓冲液通常用于控制在色谱领域中通常被视为“不需要”的二级相互作用。它们还用于控制分析物的电离状态，以确保它不会以一种以上的电离状态存在。化合物的 pKa 表示其 50% 离子化和 50% 中性的 pH 值。如果您在这个 pH 值下工作，您将看到分裂峰和可变的保留时间。所有方法都应努力使其远离目标分析物的 pKa 至少两个 pH 单位。

        二、准备好的流动相

        在制备等度流动相时，需要进一步考虑以确保良好的方法稳定性。

        尽可能预混合您的流动相，这将消除泵的错误。始终使用相同的方法进行准备；例如，如果您先加水，则应始终先加水。如果您测量单个组件然后混合，则应始终以这种方式进行。请勿更改此过程，因为分析物保留时间的结果可能会有很大差异。

        HPLC 中分析物的保留时间由流动相的极性控制。HPLC 的流动相通常使用可混溶的有机溶剂和水/缓冲液的非极性和极性混合物/组合。选择合适的流动相是 HPLC 方法开发的一个重要方面。在使用流动相和缓冲液之前，应使用溶剂进样口过滤器将其过滤，并对所有水性和有机溶剂进行脱气，以去除所有颗粒杂质并溶解气体。不锈钢材质更耐腐蚀，无需工具或配件，有效防止颗粒进入您的泵。

        三、准备好的流动相

        缓冲液浓度也很重要，通常认为低于 10mM 的浓度不能提供控制硅醇活性或化合物的电离状态所需的缓冲能力，而 10mM 将被认为是反相和 HILIC 的最小有效浓度。对于其他技术（例如尺寸排除），需要显着更高的浓度，并且这些方法的浓度超过 100 mM 的情况并不少见。缓冲液浓度必须仔细平衡，以确保在所有条件下都能达到溶解度。在反相条件下工作时，如果方法包含高水平的有机物（例如跨梯度），您可能需要限制正在使用的缓冲液的浓度，以确保不会发生缓冲液沉淀。

        检查所用溶剂的相容性、相对极性和混溶性。流动相仅使用高纯度溶剂，水应为 HPLC 级或过滤和去离子，一般透明玻璃瓶用于储存流动相，因为玻璃具有化学惰性，便于目视检查。

        流动相对选择性的贡献不亚于固定相，在开发稳健的 HPLC 色谱方法时，选择和制备的注意与批量测试固定相同样重要。