液相色谱柱色谱柱活化
　　
　　新的色谱柱活化，实际上是一个平衡的过程，活化之前必须查看包装内配套说明书，并按说明书上联系方式，与供应商核实色谱柱内保存溶剂及推荐活化步骤，若无推荐步骤可参考如下活化步骤：
　　
　　1. 反相柱活化流程：
　　
　　①甲醇或乙腈冲洗20倍柱体积;
　　
　　②若流动相含有缓冲盐，用跟流动相中盐相等比例的超纯水和有机相冲洗过渡，用量为20倍柱体积，再用含缓冲盐的流动相平衡色谱柱，用量为20倍柱体积或以上;
　　
　　③若流动相不含缓冲盐，用流动相平衡色谱柱，用量为20倍柱体积或以上;
　　
　　④最终到压力基线平稳，若不平稳可延长平衡时间。
　　
　　2. 正相柱活化流程：
　　
　　2.1 保存溶剂为正相溶剂时：
　　
　　若使用正相溶剂做流动相，可用正相流动相冲洗20倍体积。一般先用异丙醇冲洗50倍体积，可用0. 2mL/min流速，再用流动相(乙腈/水)平衡50倍体积。
　　
　　2.2 保存溶剂为反相体系时：
　　
　　若使用反相体系做流动相，使用反相溶剂冲洗20倍体积后即可使用。若使用正相体系做流动相先用异丙醇冲洗50倍体积，可用0. 2mL/min流速，再用正相流动相平衡50倍体积。
　　
　　补充：
　　
　　柱体积计算：
　　

　　
　　例：2. 5mLx-65%（没有装填的柱体积）=1. 5mL=1个柱体积

　　
　　液相色谱柱的保养
　　
　　1. 色谱柱应轻拿轻放,避免碰撞振动，放置和归还时，相应上机人员应确认保存在合适的溶剂中,并确认色谱柱两端的堵头已旋紧。
　　
　　2. 色谱柱压力升高时,应按照“标题三”步骤进行维护，色谱柱维护应在色谱柱档案备注中注明。
　　
　　3. 当出现色谱柱峰高降低,峰宽加大或出现肩峰及柱效下降时。应按照“标题四”原则进行色谱柱再生，色谱柱再生应在色谱柱档案备注中注明。
　　
　　4. 当色谱柱维护及再生后，柱效、柱压仍然不满足要求，则上报相关负责人，经负责人评估后认为确需报废的应在色谱柱档案中做好报废记录，报废后的色谱柱应专门存放,以便将来可以利用其填料修复被严重污染的色谱柱。，
　　
　　色谱柱柱压上升
　　
　　1.色谱柱柱压上升原因分析

　　
　　和柱压相关最大的是进口端筛板以及其后面1-2cm长度的柱头填料。筛板上有比填料粒径小的小孔，筛板上的小孔或柱头填料的间隙被部分堵塞，是柱压上升的主要原因。有以下几类情况：
　　
　　1.1填料破碎和使用后有填料粉末生成
　　
　　当流动相中高pH值缓冲盐使硅胶溶解并重新形成填料粉末时，会堵塞出口端筛板，这种情况下反冲不起作用，只有更换后筛板
　　
　　1.2颗粒物堵塞引起柱压上升和对策
　　
　　可能堵塞进口端筛板（前筛板）和柱头填料间隙的颗粒物来源有：样品（制样时灰尘和滤纸等带入）、进样阀密封圈磨损、流动相（溶剂本身含有和配制过程进入）、液相仪器中泵阀密封圈的磨损、缓冲盐析出（一般在梯度运行和进样时盐的溶剂环境改变导致）。
　　
　　水和缓冲盐流动相内生长的细菌，也是颗粒物来源的一种，可堵塞筛板和填料间隙。
　　
　　1.3化学污染物引起柱压上升和对策
　　
　　来源同样是样品、流动相和系统，不过来源于样品的污染最普遍，特别是对复杂基体样品未经前处理或前处理不够的时候。化学污染物主要有：分子量很大的化合物、盐类、脂质、蜡类、油脂、腐殖酸、蛋白质等其它生物来源的物质。
　　
　　像盐类这样的保留能力极小的污染物会在死体积处很快从柱中洗脱出去，检测器一般对此类物质响应不大，有时表现为干扰峰、基线波动、斑点甚至负峰；保留能力中等的污染物，会被慢慢洗出色谱柱，表现为宽峰、基线馒头形波动和基线缓慢漂移；对强保留的污染物，一般流动相强度不足以将其从柱中洗出，会逐步在柱头累积，因此需采取冲洗维护。
　　
　　2.色谱柱柱压上升解决方案
　　
　　2.1 首先判断除色谱柱外仪器压力是否正常，从柱温箱卸下液相柱，原本接液相柱的位置换成液相两通，走纯水流动相，流速1mL/min，首先判断仪器压力是否正常（一般安捷伦仪器不会超过30bar，岛津仪器一般不超过4. 0）。
　　
　　2.2若使用保护柱，应先排除是否保护柱的问题，可以先去掉或更换新的保护柱，检查压力和柱效的情况。
　　
　　2.3若仪器除色谱柱外压力正常，去掉保护柱后仍存在压力高、柱效下降等问题时，首先断开色谱柱子和检测器的连接，将管线留在色谱柱末端，将其放入接收液体的烧杯中，用以下步骤冲洗色谱柱：
　　
　　反向色谱柱：
　　
　　先用不含缓冲液盐的流动相冲洗〈水/有机相)，即90%纯水/10%有机相（甲醇或乙腈，分析流速冲洗）；
　　
　　50%纯水/50%有机相（分析流速冲洗）；
　　
　　纯有机相（甲醇/乙腈，分析流速冲洗，如果柱效恢复，则无需下一步冲洗）；
　　
　　75%乙腈/25%异丙醇（50%分析流速冲洗）；
　　
　　100%异丙醇（异丙醇粘度较大，建议冲洗流速为分析流速五分之一，避免超压）；
　　
　　100％二氯甲烷（50%分析流速冲洗）；
　　
　　100%正己烷（50%分析流速冲洗）；
　　
　　100%异丙醇（使用正己烷后，在使用之前或恢复使用反相流动相之前必须用100%异丙醇进行冲洗，必要时，流速可以再降低，但需要保证冲洗体积）；
　　
　　乙腈（（先低流速0. 3mL/min冲洗，看压力平稳后，也就是异丙醇被逐渐替换除去，再适当的增加流速到1mL/min， 需要注意压力不要骤然升高，替换出异丙醇溶液，接上检测器，再用流动相平衡色谱柱，进标样测试峰型）。
　　
　　每一步冲洗的目的：高水相冲洗残留的缓冲盐，避免后面冲洗有机相导致盐析—过渡—纯有机相冲洗反相保留较强的污染物—洗脱能力更强的流动相冲洗
　　
　　注意：
　　
　　每个步骤原则上冲洗10-20倍柱体积，可以根据实际情况适当的增加或者减少；
　　
　　② 对于压力上涨幅度较大或者柱效下降幅度较大（比如50%以上）的问题，且色谱柱粒径大于1. 8um或1. 9um粒径的色谱柱，建议直接进行反冲处理，色谱柱后端不接检测器，流出的流动相直接进废液,冲洗步骤相同。
　　
　　甲醇（或乙腈）：水＝10：90容易长菌，使用时间不可超过3天
　　
　　举例：以4. 6*250*5um规格的PLus/XDB/SB-C18色谱柱为例，操作如下：
　　
　　1. 90%水10%乙腈，流速1mL/min，冲洗体积：50mL （如果流动相或者样品中水溶性成分或者盐含量过高，可以适当延长冲洗时间）；
　　
　　2. 50%水50%乙腈，流速1mL/min，冲洗体积：25mL （过渡）
　　
　　3. 100%乙腈，流速1mL/min，50mL （如果样品或者污染物中反相保留的化合物含量过高，可以适当延长冲洗时间）；
　　
　　4. 75%乙腈/25%异丙醇，流速0. 5mL/min，冲洗25mL（过渡）；
　　
　　5. 100%异丙醇 ，流速0. 3mL/min，50mL （以上两步冲洗效果不佳的情况下，尝试异丙醇冲洗）；
　　
　　6. 100%正己烷，流速0. 5mL/min，冲洗25mL
　　
　　7. 100%异丙醇，流速0. 3mL/min，冲洗25mL
　　
　　8. 100%乙腈，流速0. 3mL/min~1 mL/min，冲洗25~50mL
　　
　　附：对于蛋白质污染反相色谱柱的清洗方法
　　
　　蛋白污染： 三氟乙酸可以降低流动相的 pH，抑制酸性硅醇基的解离，同时可作为离子对试剂，与蛋白的结合，抑制 与硅胶基质的次级作用，所以当蛋白污染色谱柱时，可考虑用以下方式冲洗： 流动相： A 0. 1%TFA， B 0. 1%TFA 乙腈 梯度： 30min B 由 10%上升至 100%，保持 10min 样品： DMSO，进样量 20uL 流速：分析流速 以 DMSO 作为样品，用梯度的方式冲洗色谱柱，建议重复 5 个循环。
　　
　　正相色谱柱（暂时只针对氨基柱）：
　　
　　100%乙腈，流速1mL/min，冲洗5倍柱体积
　　
　　100%异丙醇，流速0. 3mL/min，冲洗5倍柱体积
　　
　　50%乙腈水溶液，流速0. 5mL/min，冲洗5倍柱体积
　　
　　含0. 1%EDTA的水溶液，流速0. 5mL/min，冲洗10倍柱体积
　　
　　0. 2MoL醋酸铵水溶液，流速0. 5mL/min，冲洗20倍柱体积
　　
　　50%乙腈水溶液，流速0. 5mL/min，冲洗5倍柱体积
　　
　　100%乙腈，流速1mL/min，冲洗10倍柱体积，封存
　　
　　色谱柱一般流速推荐：4. 6mm内径柱子，柱流速：1mL/min左右；3. 0mm内径柱子，柱流速：0. 5mL/min左右；2. 1mm内径柱子，柱流速：0. 2mL/min左右。（注意：不要超过色谱柱最高耐受压力）
　　
　　三、液相色谱柱再生
　　
　　当色谱柱柱压正常，但色谱图异常时，首先更换保护柱重新进样观察色谱图，若仍然异常则判断为色谱柱柱效下降，需要进行再生步骤。柱效下降在色谱图上主要表现为6种，分别为峰形加宽变形、峰形变粗、严重拖尾、出现肩峰、峰尖分叉(双峰)及峰形畸变，分别见图1~图6。这些异常往往导致无法准确定量，对数据的准确性造成影响。
　　
　　一般而言,前3种情形受到污染的情况比较轻微,经过再生即可大大提高柱效。出现第4种峰形一般是由于色谱柱受污染较为严重,如果是发生在初期,通过再生清洗也能够恢复大部分柱效,如果长时间未进行处理,污染物与固定相已经牢固结合,则不能通过再生进行恢复,而只能通过清除被污染的固定相来进行修复了。出现第5种峰形一般是色谱柱柱头塌陷所致。第6种情形是本应为单一的色谱峰却畸变为多个色谱峰,这是污染非常严重造成的。柱头塌
　　

　　陷和严重污染均不能通过再生恢复柱效,只能通过物理方法进行修复。
　　

　　再生原则如下：
　　
　　( 1)反相柱的再生：采用甲醇：水=95：5( V：V) ,纯甲醇、二氯甲烷等溶剂作流动相,顺次冲洗，每种流动相经色谱柱的量为20～30倍柱体积,然后再用相反顺序冲洗色谱柱。
　　
　　(2)正相柱的再生：顺次用20~30倍柱体积的正己烷、异丙醇、二氯甲烷﹑甲醇作为流动相冲洗色谱柱,然后再以相反的顺序冲洗色谱柱。由于异丙醇的黏度较大,冲洗时应将流速调到0. 2 mL/ min ,以免柱压过大冲坏色谱柱。